La chiave per l'implementazione dei test di ctDNA per la rilevazione della malattia minima/molecolare residua (MRD) nei tumori solidi è la comprensione di quali caratteristiche del test di ctDNA siano importanti. Attraverso il confronto inter-test in uno studio prospettico, si dimostra come una maggiore sensibilità analitica - in questo caso tramite sequenziamento multimutazionale personalizzato - porti a miglioramenti clinicamente significativi. Queste scoperte sottolineano l'importanza di implementare i test di rilevazione di ctDNA più sensibili nei trial clinici per la rilevazione dell’MRD.
Coakley M, et al. Comparison of Circulating Tumor DNA Assays for Molecular Residual Disease Detection in Early-Stage Triple-Negative Breast Cancer. Clin Cancer Res 2024; 30(4):895-903.
I progressi nel trattamento del carcinoma mammario in stadio precoce hanno portato ad ottenere che circa l'85% delle pazienti guarisce grazie alle terapie attuali. Tuttavia, perchè ulteriori miglioramenti terapeutici non siano gravati da un overtreatment, è richiesto un affinamento degli strumenti di predizione del rischio residuo di recidiva.
La rilevazione di DNA tumorale circolante (ctDNA) nel plasma dopo il completamento del trattamento, spesso definita come rilevazione della malattia molecolare residua (MRD), è associata a un alto rischio di futura ricaduta. La rilevazione di ctDNA viene effettuata più frequentemente con test informati dal tumore, utilizzando il sequenziamento del tessuto tumorale per identificare le varianti somatiche utilizzate per sviluppare test personalizzati che tracciano alcune mutazioni con la PCR digitale (dPCR) o multiple mutazioni con il sequenziamento corretto degli errori. Test tumorali agnostici che utilizzano la rilevazione della metilazione tumorale aberrante, senza necessità di sequenziamento del tessuto tumorale, sono anche in fase di sviluppo. Con lo sviluppo crescente di più metodi di valutazione del ctDNA, sono necessari studi di confronto per identificare individuare i test ottimali da implementare negli studi clinici e nella pratica clinica futura.
Lo studio clinico prospettico c-TRAK-TN ha identificato pazienti con MRD dopo il trattamento per carcinoma mammario triplo-negativo (TNBC) in stadio precoce, a moderato-alto rischio di recidiva e ha valutato l'attività potenziale di ulteriori terapie adiuvanti con pembrolizumab dopo la rilevazione di MRD.
È stata osservata una maggiore incidenza di malattia metastatica al momento della rilevazione di MRD con dPCR nello studio clinico c-TRAK TN rispetto a quanto previsto, sottolineando la necessità di valutare se i test di ctDNA con una migliore sensibilità possano allungare il tempo di anticipo dalla rilevazione di MRD alla ricaduta clinica e facilitare gli studi clinici progettati per migliorare gli esiti dei pazienti con interventi al momento della rilevazione di MRD.
Questo studio pilota ha valutato la capacità dei test di sequenziamento personalizzati "Residual Disease and Recurrence" (RaDaR) informati dal tumore (NeoGenomics) di rilevare. Successivamente, i test RaDaR sono stati confrontati con test dPCR informati dal tumore condotti prospetticamente nello studio clinico c-TRAK TN.
Studio c-TRAK-TN: multicentrico di fase II condotto su pazienti con TNBC in stadio precoce e con malattia residua dopo chemioterapia neoadiuvante e chirurgia o con una dimensione tumorale > 20 mm e/o coinvolgimento dei linfonodi ascellari prima della chirurgia primaria e chemioterapia adiuvante. Lo studio prevedeva di sequenziare un campione di tessuto tumorale con un test mirato, progettando test dPCR personalizzati per una o due mutazioni per paziente. Dopo il completamento della terapia standard, le pazienti venivano sottoposte a test dPCR prospettici ogni 3 mesi per 2 anni. In caso di ctDNA rilevato durante i primi 12 mesi di test (o entro i 15 o 18 mesi se i pazienti non avevano potuto effettuare il test a causa della pandemia di COVID-19), la randomizzazione assegnava a osservazione vs.pembrolizumab. Co-primary endpoint: (i) tasso di rilevamento del ctDNA a 12 mesi e (ii) tasso di eliminazione mantenuta nel tempo del ctDNA con pembrolizumab.
Il DNA è stato estratto da tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) dopo microdissezione. Le librerie sono state sequenziate su piattaforma NovaSeq6000 di Illumina. Per i test di ctDNA tramite dPCR, sono state utilizzate sequenze mirate da due campioni FFPE. L'analisi RaDaR (Residual Disease and Recurrence) è stata eseguita utilizzando varianti somatiche precedentemente identificate tramite sequenziamento dell'esoma intero. Sono stati sviluppati pannelli di primer personalizzati per ogni paziente e le varianti sono state validate utilizzando campioni di DNA tumorale o plasmatico.
Nel primo studio pilota dove è stata valutata l'efficacia di RaDaR nella rilevazione di MRD sono state arruolate 170 pazienti e sono state identificate 17 pazienti con ricaduta e 5 pazienti senza ricaduta. Utilizzando il sequenziamento dell'esoma intero (WES), sono stati sequenziati campioni di tessuto tumorale e buffy coat, e sono stati progettati pannelli di sequenziamento personalizzati. È stata osservata una rilevazione di ctDNA nel 39.7% dei campioni di plasma, con una correlazione significativa tra la rilevazione di MRD e il tempo alla ricaduta. RaDaR ha rilevato MRD in tutti i pazienti con ricaduta nota e non ha rilevato MRD nei pazienti senza ricaduta. Il tempo mediano alla ricaduta libera da malattia (RFS) nei pazienti con MRD rilevato è stato di 16.8 mesi. Inoltre, RaDaR ha rilevato MRD in media 6.1 mesi prima della ricaduta, confermando la sua elevata sensibilità.
Nel c-TRAK TN trial, sono stati arruolati 161 pazienti per la valudazione prospettica del MRD tramite dPCR. Successivamente, sono stati testati retrospettivamente con RaDaR.
L’MRD è stata rilevata per la prima volta tramite sequenziamento personalizzato nel 47.9% delle pazienti, nello 0% tramite dPCR e nel 52.1% con entrambi i test contemporaneamente (P < 0.001; test esatto di Fisher). Il tempo mediano dal rilevamento del ctDNA alla ricaduta è stato di 6.1 mesi con il sequenziamento personalizzato e di 3.9 mesi con la dPCR (P = 0.004, modello Cox a effetti misti). L'accordo tra i due test è stato del 93.3%, con RaDaR che ha rilevato MRD in un numero maggiore di pazienti rispetto alla dPCR e in molti casi in anticipo.
Il rilevamento dell’MRD al primo timepoint stato associato a un tempo più breve fino alla ricaduta rispetto al rilevamento ai punti temporali successivi (tempo mediano 4.2 vs 7.1 mesi; P = 0.02).
La rilevazione di ctDNA dopo 12 mesi dalla fine del trattamento è stata più frequente con dPCR rispetto a RaDaR.
L'analisi di RaDaR ha mostrato una sensibilità del 95.7% e una specificità del 91.0% nel predire la ricaduta a 24 mesi. Le discordanti risposte tra RaDaR e dPCR si sono verificate nel 7.1% dei pazienti, ma RaDaR ha dimostrato di avere una sensibilità superiore nel rilevare la ricaduta in diversi siti rispetto alla dPCR.
Sono in fase di sviluppo clinico molteplici test di ctDNA per la rilevazione dell’MRD, ed è essenziale comprendere se le differenze tra i test hanno conseguenze cliniche con risultati consistenti
Il sequenziamento personalizzato multimutazionale con il test RaDaR rileva frequentemente il ctDNA in un momento precedente rispetto alla dPCR, anticipando il tempo di rilevamento rispetto alla ricaduta clinica, senza impatto discernibile sulla specificità.
Nel trial cTRAK-TN, RaDaR ha dimostrato di rilevare precocemente il ctDNA in pazienti con carcinoma mammario triplo negativo (TNBC), prima che diventassero clinicamente evidenti.
L'aumentata sensibilità di RaDaR ha ridotto la durata richiesta della sorveglianza del ctDNA nel TNBC a moderato o alto rischio, con la maggior parte delle ricadute rilevate entro i primi 12 mesi dal completamento della terapia standard.
La localizzazione della ricaduta può influenzare i livelli di rilevamento del ctDNA, con metastasi polmonari che mostrano livelli inferiori di rilevamento rispetto ad altri siti di malattia.
Questi risultati suggeriscono l'importanza dell'implementazione dei test di sequenziamento personalizzato nei trial clinici e sottolineano i benefici potenziali dello sviluppo ulteriore dei test per migliorare ulteriormente la sensibilità analitica e la rilevazione del ctDNA.